Содержание статьи:
Представляю вашему вниманию подробный научный доклад по теме «Цифровая ПЦР — новое поколение метода ПЦР для высокоточных приложений. Презентация системы цПЦР D600, Maccura», основанный на содержании тематического вебинара .
Компания Диаэм продолжает серию вебинаров, посвящённых новым решениям в области молекулярной диагностики. Сегодняшняя тема — цифровая ПЦР (dPCR). Хотя эта технология уже активно используется во многих направлениях, не все специалисты до конца понимают её отличия от классической ПЦР в реальном времени (qPCR). Цель настоящего доклада — предоставить обзор технологии цифровой ПЦР и продемонстрировать её практическое применение.
История ПЦР начинается в 1976 году с выделения ДНК-полимеразы Taq из термофильной бактерии Thermus aquaticus.
1988 года Кэри Мюллис и корпорация Cetus коммерциализировали фермент для широкого использования. ДНК-полимераза Taq имела мгновенный успех, журнал Science в 1989 году присудил титул "Молекула года".
Однако ДНК-полимераза Taq не была идеальной. Фермент был нестабилен при высоких температурах и делал ошибки, а также трудности возникали с амплификацией ДНК, богатой GC или со сложной вторичной структурой.
В 1991 году была выделена полимераза Pfu, полученная из гипертермофильного архея Pyrococcus furiosus. ДНК-полимераза Pfu, в отличие от ДНК-полимеразы Taq, обладает 3' - 5' экзонуклеазной активностью, что означает, что она может исправлять ошибки включения нуклеотидов.
Введение гибридных ДНК-полимераз в практику в 2003 году стало шагом в разработке действительно высокоточной и высокопроцессивной ПЦР. Созданные путем слияния основных компонентов архебактериальной полимеразы с термостабильным ДНК-связывающим доменом, высокоточные ДНК-полимеразы Phusion обладают высокой пруф-ридинг способностью и невероятно стабильны при высоких температурах реакции.
Для задач с низкокопийными матрицами классическая ПЦР и кПЦР демонстрировали ограничения. В конце 1990-х годов Вогельштейн и Кинцлер ввели термин «цифровая ПЦР» (digital PCR, dPCR). Первый коммерчески успешный прибор — QX100 от Bio-Rad — стал доступен в 2011 году.
На данный момент можно выделить три поколения ПЦР:
Первое поколение ПЦР (ПЦР по конечной точке, «классическая» ПЦР) для анализа накопленных продуктов использует гель-электрофорез, что ограничивает метод низким пределом обнаружения, трудоемкостью процедуры и, по сути, возможностью только качественного анализа. Второе поколение ПЦР (количественная ПЦР, реал-тайм) позволяет количественно определять продукты, однако только при наличии референсных или стандартных образцов, а также демонстрирует низкую толерантность к ингибиторам, влияющих на эффективность реакции. Несмотря на огромную популярность реал-тайм, как метода определения нуклеиновых кислот во многих клинико-диагностических направлениях, возникла необходимость улучшения точности технологии для детекции единичных копий или низких концентраций нуклеиновых кислот в образцах.
Цифровая ПЦР (цПЦР) — это третье поколение ПЦР, которое является эволюционным продолжением двух предыдущих технологий и инкорпорирует их основные принципы. Так, в цПЦР детектируется флуоресцентный сигнал по конечной точке, то есть после завершения реакции амплификации. Однако уникальные возможности цифровой ПЦР обусловлены совершенно новым подходом к реализации формата проведения анализа.
В цифровой ПЦР образец разделяется на тысячи микрореакций (капли или отсеки), в каждой из которых происходит амплификация мишени, при ее попадании в микрореакцию. Положительные реакции фиксируются по флуоресцентному сигналу. Математически процесс описывается распределением Пуассона. Это позволяет точно рассчитать концентрацию искомой мишени.
|
Параметр
|
qPCR
|
Цифровая ПЦР
|
|
Определение количества
|
Относительное
|
Абсолютное
|
|
Чувствительность
|
До 1 копии, но при очень большом количестве технических повторов
|
1 копия
|
|
Динамический диапазон
|
10 порядков
|
5 порядков
|
|
Наличие стандарта
|
Обязательно
|
Не требуется
|
|
Работа с ингибиторами
|
Чувствительна
|
Устойчива
|
|
Стоимость анализа
|
Низкая
|
Выше, но снижается с развитием технологий
|
Уменьшение объема реакции (до 1 нл) в dPCR повышает эффективность амплификации и снижает уровень фонового шума.
Цифровая ПЦР рекомендована для применения во многих областях, например:
- Диагностике онкологических заболеваний.
- Пренатальной диагностике.
- Оценке вирусной и бактериальной нагрузки.
- Детекции ГМО.
- Тестировании антимикробной резистентности.
- Определении остаточной болезни
- Анализа ГМО
Существуют два основных подхода:
- Капельная dPCR — амплификация в каплях эмульсии (наиболее известен Bio-Rad QX200).
- Чиповая (chamber-based) dPCR — амплификация в изолированных камерах.
Обе технологии обеспечивают высокую чувствительность и точность.
Диаэм рада объявить о сотрудничестве с компанией Maccura, ведущем производителем оборудования для клинической диагностики в Китае, и представить высокопроизводительную систему капельной цифровой ПЦР D600. Прибор представляет собой компактную систему, автоматически осуществляющую все операции на одном борту: генерация капель, термоциклирование, считывание сигнала. С помощью удобного интерфейса ПО легко запрограммировать реакцию и провести анализ результатов.
Особенности D600:
- Гибкая настройка: 5, 10 или 20 тыс. капель на образец.
- Высокая производительность: до 24 образцов при генерации 20 тыс. капель на образец.
- Стоимость анализа ниже большинства конкурентов.
- Поддержка мультиканальной детекции (2-6 каналов).
Уникальная технология генерации капель с помощью микровибрации позволяет получать однородные капли (вариация размера — всего 3%).
Maccura предлагает готовые и кастомизируемые наборы для детекции:
- Инфекционных заболеваний.
- Генетических мутаций.
- Вариаций числа копий (CNV).
- Метилирования.
CNV – вид генетического полиморфизма, возникающий в результате несбалансированных хромосомных перестроек, таких как делеции и дупликации. Результатом вариации может явиться снижение или повышение числа копий определенного гена и, следовательно, пониженная или повышенная экспрессия продукта гена – белка или некодирующей РНК.
Минимум 12% человеческого генома подвергается вариациям числа копий. Вклад CNV в вариативность генома сопоставим с вкладом однонуклеотидных полиморфизмов или даже превышает его.
Иногда эти вариации никак не влияют на здоровье человека, у которого они есть, но иногда они могут играть роль в развитии заболевания. Например, роль CNV показана в формировании расстройств аутистического спектра, нарушений развития нервной системы и аутоиммунных заболеваний.
Изменение числа копий гена является одним из основных механизмов изменения степени экспрессии потенциальных онкогенов и генов-супрессоров опухолей раковыми клетками.
Было показано, что повторяющиеся делеции обычно чрезмерно представлены в генах-супрессорах опухолей и недостаточно представлены в онкогенах. В среднем геном образца опухоли на 17% состоит из амплифицированных участков и на 16% из делеций по сравнению со средними показателями 0,35% и менее 0,1% в нормальных образцах соответственно.
В генетике рака CNV делятся на два класса в зависимости от их размера:
- крупные, также известные как варианты уровня плеча хромосомы, охватывающие > 25% или ⅓ плеча хромосомы.;
- фокальные варианты, определяемые как небольшие участки генома, содержащие до нескольких генов. Затрагивают:
- амплификацию онкогенов (EGFR, MYC, ERBB2)
- делецию генов-супрессоров (PTEN, P53)
- эпигенетических регуляторы
Так, амплификация гена ERBB2 (он же Her-2/neu). Данный вид мутации имеет большое значение в развитии рака молочной железы и влияет на тактику лечения данного заболевания. Амплификация ERBB2 выявляется примерно у каждой третьей пациентки
Дискриминация между последовательным числом копий сложнее при возрастании копийности и требует более высокой точности. Такая точность затруднительна в случае непрямых относительных методов: кПЦР, сравнительной геномной гибридизации на чипах, исследованиях SNP.
Определение CNV в гетерогенных образцах - это функция от:
- Степени амплификации гена
- Фракции клеток, в которых произошло изменение
Сравнение методов анализа:
- кПЦР (qPCR) — Относительное, не абсолютное измерение.Воспроизводимость
- гибридизация на микрочипах ( CGH ) — Цена. Участки с CNV часто пропускаются. Разрешение: ненадежное при высоких количествах копий
- флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) Трудо- и время-затратно. Цена.Низкая пропускная способность
- массовое параллельное секвенирование (NGS) — высокая стоимость, сложность анализа, ложноположительные результаты.
При этом, метод цифровой ПЦР позволяет определить абсолютное количество амплифицированных участков «гена интереса», исходя из числа копий референсного гена, экспрессия которого не меняется.
Формула расчёта числа копий:
Исследование, опубликованное в Molecular Cancer (Nature Group), продемонстрировало изменение тактики лечения пациенток с метастазирующим ER+ HER2- раком молочной железы, у ктороых методом цПЦР (в частности D600) была выявлена амплификация гена S6K1. Такая группа пациентов резистентна к терапии ингибиторами CDK4/6 и им назначают комбинацию препаратов антагонистов.
Цифровая ПЦР (dPCR) — мощный инструмент для задач, требующих высокой точности. Обеспечивает:
- Абсолютный количественный анализ.
- Высокую чувствительность (до 1 копии).
- Устойчивость к ингибиторам.
- Быструю автоматизация.
Система D600 (Maccura) — высокопроизводительное решение для dPCR, доступное на российском рынке благодаря компании ДИАЭМ.
