Сэнгер жив

• Введение: место Сенгера в современном секвенировании
• Основы метода Сенгера: как это работает
• Этапы секвенирования?
  1. ПЦР-амплификация
  2. Очистка ПЦР-продукта
  3. Циклическое секвенирование
  4. Очистка после секвенирования
• Капиллярные секвенаторы и их устройство
  1. Принцип работы
  2. Оборудование
  3. Расходные материалы и совместимость
  4. Калибровка и обслуживание
• Заключение

Эта публикация отражает содержание доклада «Сэнгер — жил, Сэнгер — жив, Сэнгер — будет жить… настоящее и будущее капиллярных генетических анализаторов», прочитанного на одноименном вебинаре 13 февраля 2024 года.

Введение: место Сенгера в современном секвенировании

Несмотря на стремительное развитие технологий высокопроизводительного секвенирования (NGS), секвенирование по Сенгеру продолжает занимать важную долю — около 15–20% от всех применений секвенаторов в мире. Технологии второго поколения (NGS) и мономолекулярного секвенирования (Oxford Nanopore, PacBio и др.) сегодня лидируют, однако капиллярные секвенаторы по-прежнему востребованы. Их применяют как для определения последовательностей (секвенс), так и для фрагментного анализа — технологий, решающих широкий спектр задач.

Основы метода Сенгера: как это работает

Секвенирование по Сенгеру — это метод определения последовательности нуклеотидов ДНК. По своей сути, это односторонняя ПЦР-реакция с использованием одного праймера и флуоресцентно меченых дидезоксинуклеотидов (терминаторов), которые случайным образом встраиваются в цепь и останавливают её удлинение. В результате образуются фрагменты ДНК разной длины, каждый из которых заканчивается меткой определенного цвета. Эти фрагменты разделяются по длине методом капиллярного электрофореза, и на основе флуоресцентного сигнала считывается последовательность.

Максимальная длина прочтения — до 800 пар оснований, а точность метода достигает 98% (1 ошибка на 100 нуклеотидов).

Этапы секвенирования

Процесс включает несколько ключевых стадий:

1. ПЦР-амплификация
   Для начала необходимо получить достаточное количество матрицы ДНК. Для этого используется амплификатор (термоциклер), например:
   • Jinxplorer (Bayer Technologies, Китай) — шесть моделей с удобным тачскрином и элементами Peltier.
   • TurboCycler 2 и 3 (Blu-ray Biotech, Тайвань) — шесть моделей с удобным тачскрином и элементами Peltier.
2. Очистка ПЦР-продукта
   Необходимо удалить праймеры и соли. Для этого используются:
   • Наборы на колонках Diagen (50 и 250 реакций);
   • Магнитные частицы Магнофер (Беларусь), которые показали отличные результаты очистки.
3. Циклическое секвенирование
   Применяются наборы реагентов:
   • Классический BigDye Terminator (Applied Biosystems);
   • Российский аналог Novodai Terminator 3.1, полностью совместимый с приборами и спектральной калибровкой BigDye.
4. Очистка после секвенирования
   Методы:
   • Простой осадок спиртом (может ухудшать качество сигнала);
   • Наборы Exterminator, полностью совместимый с приборами и спектральной калибровкой BigDye.
   • Очистка магнитными частицами Deepure (Nemogen) или Магнофер.

Капиллярные секвенаторы и их устройство

Принцип работы

ДНК-цепи движутся в капилляре под действием электрического тока в полимерной среде. Проходя через окно детекции, меченые фрагменты возбуждаются лазером, и сигнал фиксируется камерой через оптическую систему. Это формирует электрофореграмму — график с пиками флуоресценции.

Оборудование

Классические приборы:

• Applied Biosystems 3500, 3730, SeqStudio — самые распространённые в РФ;
• SeqStudio Flex — гибрид, объединивший функциональность предыдущих поколений.

Альтернативы:

• Healthgene Technologies (Китай) — серия G (8, 16, 24 капилляра) и H16. Без RFID, с открытой системой и возможностью использовать нестандартизованные расходные материалы.

  
  

• Преимущества: капилляры на 36, 50, 80 см, оптоволоконная передача сигнала, высокая совместимость, удобный софт с русским интерфейсом.

Расходные материалы и совместимость

Для многих лабораторий важна доступность расходки к приборам, особенно к 3500 от ABI. Компания Диаэм предлагает:

• Полимеры Vostok 7 и 4 с RFID-метками;
• Буферные наборы Vostok с возможностью замены меток;

  
  

• Капилляры, планшеты (включая оригинальные и аналоги от Abclon, Sovtech);
• СЕПТЫ от Sovtech с регистрационным удостоверением;
• Формамиды (Applied, GTZ, белорусские) — только высокоочищенные, замороженные.

Примеры:

• Использование Vostok 7 с прибором 3500 показало отличные результаты при прочтении 400+ нуклеотидов, даже при очистке просроченными частицами.
• В комбинации с 3130 и 80-см капилляром получено прочтение более 900 нуклеотидов.

Калибровка и обслуживание

Для стабильной работы капиллярного секвенатора необходимы:

• Пространственная калибровка — при смене капилляра, открытии окна детекции или перемещении прибора;
• Спектральная калибровка — при смене набора красителей или капилляров другой длины, а также при снижении качества сигнала.

Программное обеспечение приборов Healthgene Technologies доступно на русском языке и предлагает удобную визуализацию результатов.

Заключение

Секвенирование по Сенгеру остается актуальным методом с высокой точностью и стабильностью. Компания Диаэм предлагает полный спектр решений: от оборудования и реагентов до расходных материалов и консультационной поддержки. В условиях ограниченного импорта это особенно важно — доступны отечественные и совместимые аналоги мировых брендов, а также поддержка при внедрении.

Страница вебинара Сэнгер — жил, Сэнгер — жив, Сэнгер — будет жить… настоящее и будущее капиллярных генетических анализаторов от 13 февраля 2024 года.