Содержание статьи:
Эта публикация отражает содержание доклада
«Что посеешь, то и пожнешь — актуальные решения для оценочного анализа нуклеиновых кислот», прочитанного на одноименном вебинаре.
Сегодня мы продолжаем серию вебинаров, посвященных решениям для молекулярной генетики.
Темой данного вебинара является оценка качества и количества нуклеиновых кислот, которые используются на последующих этапах:
- постановка ПЦР;
- фрагментный анализ;
- различные виды секвенирования (включая NGS);
- другие молекулярно-генетические методы.
Почему оценка качества и количества так важна?
Потому что современные молекулярно-генетические технологии — особенно массовое параллельное секвенирование (NGS) — по-прежнему остаются дорогостоящими.
Ошибки на входном этапе приводят к перерасходу реагентов, дорогих картриджей, а в итоге — к потере времени и средств.
Проще и дешевле заранее оценить качество исходного материала, чем потом сталкиваться с некорректными результатами.
Сегодня в лабораториях применяют следующие методы (см. слайд):
- Флуориметрический метод;
- Горизонтальный электрофорез в агарозных гелях;
- Спектрофотометрия;
- Фрагментный анализ с лазерной детекцией;
- Количественная ПЦР (qPCR, ПЦР в реальном времени).
Мы подробно рассмотрим ключевые методы, с практическими рекомендациями.
Флуориметрия — исключительно количественный метод.
Принцип:
- Используются два стандарта с известной концентрацией.
- Образец смешивается с интеркалирующим красителем, который встраивается в целевую нуклеиновую кислоту.
- После инкубации измеряется флуоресценция образца и стандартов → строится калибровочная кривая → по ней рассчитывается концентрация нуклеиновой кислоты в растворе.
Плюсы метода:
- Высокая точность и специфичность.
- Нижний предел — несколько сотых нг/мкл.
- Быстрое выполнение (~5 секунд).
- Недорогое оборудование.
Минусы метода:
- Измеряется суммарная нуклеиновая кислота, нельзя выделить отдельные фрагменты.
- Реагенты — относительно дорогие, с коротким сроком годности.
- Невозможно оценить чистоту выделенной нуклеиновой кислоты.
Приборы:
Эталонный прибор:
- Qubit (Invitrogen / Thermo Fisher Scientific).
Популярные китайские аналоги:
- Alsheng FLUO 100B, FLUO 200, FLUO 800.
Мы провели в лаборатории сравнительное тестирование приборов Qubit 4, Alsheng FLUO 100B, FLUO 200 и встроенного флуориметра Nano-500.
Основные характеристики:
|
Параметр
|
Qubit 4
|
Alsheng FLUO 100B
|
Alsheng FLUO 200
|
|
Каналы
|
2 (синий, красный)
|
2
|
2
|
|
Пробирки
|
0.5 мл
|
0.5 мл
|
0.5 мл
|
|
Время измерения
|
~5 секунд
|
~5 секунд
|
~5 секунд
|
|
Нижний предел
|
~0.5 пг/мкл
|
~0.5 пг/мкл
|
~0.5 пг/мкл
|
|
Линейный диапазон
|
~5 порядков
|
~5 порядков
|
~5 порядков
|
Плюсы и минусы приборов
Qubit 4:
- Плюсы: интуитивный интерфейс, высокая точность на низких концентрациях, стабильность.
- Минусы: высокая цена, нельзя сохранять мультикалибровки.
Alsheng FLUO 100B:
- Плюсы: поддержка мультикалибровок, низкая стоимость.
- Минусы: неинтуитивный интерфейс, маленькая память (до 30 измерений).
Alsheng FLUO 200:
- Плюсы: большой тачскрин, сохранение данных в PDF, встроенные калибровки.
- Минусы: немного дороже 100B (~в 1,5 раза).
Практическое сравнение
При концентрациях от 100–200 нг/мкл — все модели, кроме встроенного флуориметра Nano-500, дают сходные результаты.
При низких концентрациях (до 10 нг/мкл) встроенный Nano-500 дает некорректные данные.
Вывод: FLUO 100B / FLUO 200 и Qubit 4 — демонстрируют сопоставимые результаты.
В этом году ожидается выход EasyCube (Blu-ray Biotech, Тайвань):
- Два варианта — с 2 или 3 каналами (дополнительно — зелёный канал).
- Подключение по USB или Wi-Fi.
- Интуитивный интерфейс, аналогичный EZ-DROP.
- Будут поставляться собственные наборы под:
- Двуцепочную ДНК (до 100 нг, High Sensitivity);
- В перспективе — под ssDNA и РНК.
Спектрофотометр — незаменимый инструмент для качественной и количественной оценки нуклеиновых кислот.
Возможности:
- Количественный анализ (260 нм).
- Оценка чистоты:
- 260/280 — белковые загрязнения;
- 260/230 — органические примеси.
- Быстрая экспресс-оценка.
Приборы:
Мы активно используем EZ-DROP (Blu-ray Biotech):
- EZ-DROP 1000 — только капля.
- EZ-DROP 1000C — капля + кювета (термостатируемая).
Сравнение с NanoDrop 2000
Проводили тестирование на чистой плазмидной ДНК, с контролем по Qubit.
Результаты:
- При концентрациях до 10 нг/мкл — разброс до 50%.
- При более высоких концентрациях — хорошая воспроизводимость.
- EZ-DROP занижает показания не более чем на 10% (по сравнению с Qubit).
Вывод: EZ-DROP работает сопоставимо с NanoDrop.
Фрагментный анализ — обязательный этап для:
- Оценки NGS-библиотек.
- Оценки геномной ДНК.
- Оценки целостности РНК.
- Скрининга ПЦР-продуктов.
Приборы Agilent (стандарт отрасли):
- Bioanalyzer 2100.
- TapeStation 4150 / 4200.
Недостатки:
- Высокая стоимость приборов.
- Очень дорогие расходники.
- На мировом рынке — более 10 лет.
- В России — более 6 лет.
- Применяется капиллярный электрофорез.
Модели:
- Qsep-1 (до 18 образцов).
- Qsep-100 (до 96 образцов).
Преимущества Qsep:
- Прибор дешевле, чем Agilent.
- Расходники дешевле.
- Электрофорез — поочередный → экономия геля.
- Очень простое обслуживание.
Технология работы:
- Гель с интеркалирующим красителем.
- Электрокинетическая инжекция → капилляр → лазерная детекция.
- Время анализа: 2–7 минут на образец.
Картриджи:
- Для качественного анализа.
- Для количественного анализа.
- Для РНК.
- Для белков.
- Картридж на 100–200 образцов.
Софт:
- Интуитивный интерфейс.
- Гибкое создание протоколов.
- Поддержка пользовательских параметров.
Примеры результатов:
1. Геномная ДНК:
- Высокая целостность → чёткий пик.
- Развалившаяся ДНК → широкий фронт.
2. Фрагментированные библиотеки:
- CUSep показывает полностью сопоставимые результаты с TapeStation.
3. Скрининг ПЦР:
- Картридж F3 — быстрый скрининг (1,5 мин).
4. Целостность РНК:
- RQN индекс.
- Соотношение 18S/28S.
- Встроенный режим для прокариотической РНК.
Экономика применения:
|
Метод
|
Стоимость/библиотека
|
|
Qsep
|
~30 руб.
|
|
Agilent
|
~680 руб.
|
Вывод: экономия очевидна, при сопоставимом качестве анализа.
На этапе оценки качества и количества нуклеиновых кислот крайне важно подобрать оптимальный инструмент:
- Для количественного анализа — Qubit / Alsheng / EasyCube.
- Для чистоты и качественной оценки — спектрофотометр EZ-DROP.
- Для NGS-библиотек, ДНК, РНК, ПЦР — капиллярный анализатор BIOptic CUSep.
CUSep демонстрирует отличное качество по сравнению с системами Agilent, при значительно более низкой стоимости.
Резюме: зачем платить больше, если можно получить то же качество за меньшие деньги.
Компания DIM готова предоставить:
- демонстрацию оборудования;
- подбор оптимального решения;
- поставку приборов и расходников;
- поддержку.
