Содержание статьи:
Эта публикация отражает содержание доклада
«Новые лица хорошо известных методов: всё необходимое для ПЦР и электрофореза», прочитанного на одноименном вебинаре
7 марта 2024 года.
Меня зовут Светлана Олейникова, я представляю направление геномики компании Диаэм. В этой статье я хочу подробно рассказать обо всём, что нужно для эффективной работы с полимеразной цепной реакцией (ПЦР), а также для анализа результатов с помощью агарозного гель-электрофореза. Статья будет полезна и для опытных специалистов, и для тех, кто только начинает работать в лабораториях молекулярной биологии.
Мы рассмотрим широкий спектр компонентов для ПЦР — от классических ДНК-полимераз до высокоточных ферментов, мастер-миксов и реагентов для изотермической амплификации. Обратим внимание на вспомогательные решения, например, для контроля контаминации и стабилизации РНК, а в конце подробно поговорим об оборудовании для гель-электрофореза и системах гель-документирования.
Когда мы говорим о ПЦР, в первую очередь стоит обсудить ферментативный компонент. Основа любой ПЦР — это ДНК-полимераза. В нашем ассортименте представлены все ключевые классы ферментов.
Для базовых задач отлично подходит классическая Taq ДНК-полимераза. Мы предлагаем фермент собственного производства под маркой diaGene , а также альтернативный вариант от компании Vazyme — китайского производителя с проверенным качеством. Такие полимеразы востребованы для стандартных амплификаций, когда нет особых требований к точности.
Однако если необходима повышенная специфичность или работа с проблемными матрицами, стоит обратить внимание на Taq ДНК-полимеразы с горячим стартом. Они существенно снижают риск неспецифической амплификации за счёт инактивации фермента до начальной денатурации. Мы предлагаем два варианта: Hot Start Taq-полимераза (инактивирована антителами) и RTaq ДНК-полимераза (химически инактивирована, что упрощает протокол: активация фермента происходит в течение первой денатурации, дополнительный нагрев не требуется).
Для более сложных задач требуются высокоточные ДНК-полимеразы. Классическое решение — Pfu ДНК-полимераза. Для более требовательных приложений мы предлагаем Super Fusion ДНК-полимеразу (точность в 15 раз выше, устойчивость к ингибиторам) и Phanta Max (точность в 53 раза выше, аналог Fusion-полимераз ведущих мировых брендов). Для тех, кто работает в условиях жёстких временных ограничений, интересен супер-микс Fanta Flash с рекордной скоростью амплификации — до 1 кб/сек с превосходной точностью, в 81 раз выше, чем у Taq ДНК-полимеразы.
Существенно упростить лабораторные процедуры позволяют готовые мастер-миксы. Для классической ПЦР доступны как стандартные Hot Start-миксы, так и специальные формулы для ГЦ-богатых матриц и длинных ампликонов. Весь спектр представлен в линейке diaGene, что позволяет лабораториям экономить без потери качества.
Особое внимание стоит уделить решениям для qPCR. В ассортименте представлены мастер-миксы как с SYBR Green, так и с флуоресцентными зондами. Они оптимизированы для сложных матриц и гарантируют высокую чувствительность и воспроизводимость.
Кроме того, мы предлагаем интересные специализированные решения. Например, супер-микс EpiArt прекрасно работает с ДНК после бисульфитной конверсии — актуально для эпигенетических исследований. А технология прямой ПЦР (Direct PCR) позволяет полностью исключить стадию выделения ДНК: вы работаете с тканями или кровью напрямую, экономя время и снижая вероятность потерь материала.
Изотермическая амплификация, в частности LAMP, завоевывает всё большую популярность благодаря простоте и скорости. В отличие от ПЦР, процесс идёт при постоянной температуре (~60 °C), что снимает требования к термоциклеру. Здесь критично выбрать правильную полимеразу — у нас это LAMP ДНК-полимераза (аналог BST), которая демонстрирует отличные результаты.
Для мониторинга реакции мы предлагаем компактный изотермический амплификатор с детекцией в реальном времени Lampix 8. Он позволяет эффективно контролировать процесс и получать точные результаты даже при работе с небольшими сериями образцов.
Любая работа с ПЦР сопряжена с риском перекрёстной контаминации ампликонами. Для эффективного контроля мы предлагаем ExitNA — готовый раствор, полностью разрушающий нуклеиновые кислоты. Он безопасен для пользователя, не требует специальных условий применения и подходит для обработки любых лабораторных поверхностей, инструментов и даже рук.
При работе с РНК задача усложняется — нужно эффективно провести обратную транскрипцию. Здесь мы предлагаем широкий выбор обратных транскриптаз.
Собственная линейка diaGene включает ферменты с различной термостабильностью — от Smart RT до Super RT (работа до 70 °C), что особенно важно при работе с РНК, склонной к образованию вторичных структур.
Дополнительно доступны обратные транскриптазы Vazyme, в том числе HiScript- II и HiScript-III, обеспечивающие синтез длинной КДНК (до 20 кб) и демонстрирующие высокую устойчивость к ингибиторам.
Для повышения удобства в работе у нас есть наборы и экстра-миксы — решения «всё в одном», оптимальные для рутинных протоколов и сложных матриц.
РНК крайне чувствительна к деградации. Для надёжной стабилизации материала мы предлагаем российские разработки под маркой diaGene:
• Riti— для тканей.
• RiSave + RiTube— для крови и костного мозга.
Решения полностью совместимы с downstream-анализами, включая ПЦР и секвенирование. Аналоги подобных реагентов ранее поставлялись только крупнейшими зарубежными производителями.
Агарозный гель-электрофорез остаётся важнейшим методом контроля результатов ПЦР. Компания Диаэм предлагает полный спектр решений для этой задачи.
Наш ассортимент агароз охватывает все потребности — от рутинного анализа до сложных препаративных задач. Доступны агарозы с различными уровнями EEO для оптимального разрешения фрагментов любого размера.
Буферы TBE и TAE готовы к использованию, доступны в различных фасовках. Маркеры длин ДНК представлены широкой линейкой с шагом от 24 до 10 000 п.о., включая как готовые маркеры, так и концентраты.
Особое внимание стоит уделить инновационным буферам Peach, Red и Purple — они позволяют по цвету отслеживать прогресс миграции фрагментов, что значительно упрощает контроль процесса.
Для окрашивания доступны как классический бромистый этидий, так и безопасные альтернативы (dsGreen, dsSafe, ssGreen, Lumiprobe).
Мы предлагаем проверенные решения для проведения гель-электрофореза:
• Mupid-exU (Япония) — компактная камера с интегрированным источником питания.
• SVL-2 Электрофорезная горизонтальная камера, Servicebio — интеграция с трансиллюминатором синего цвета позволяет наблюдать процесс в реальном времени.
Источники питания доступны как зарубежные (Wix), так и отечественные (Эльф-2, Эльф-4) — компактные, надёжные, с оптимальными характеристиками для проведения гель-электрофореза.
Для гель-документирования мы рекомендуем гель-документирующие системы MINI Space (Tanon). Они просты в управлении, оснащены современными LED-источниками и автоматической фокусировкой. Для более сложных задач доступны Chemi Dog ULTRA и Chemi Dog 5200T — профессиональные решения для вестерн-блоттинга, хемилюминесценции и мультиплексного анализа.
Современные технологии ПЦР и гель-электрофореза требуют не только качественных ферментов и реагентов, но и продуманного оборудования. Компания ДиАЭМ предлагает полный спектр решений, позволяя лабораториям работать эффективно, надёжно и экономично. Независимо от задач — будь то стандартная или высокоточная ПЦР, работа с РНК или постановка гель-электрофореза — мы готовы помочь вам подобрать оптимальные компоненты и обеспечить методическую поддержку.
Страница вебинара «Новые лица хорошо известных методов: всё необходимое для ПЦР и электрофореза»
от 7 марта 2024 года.
