Downstream-процессы в биотехнологии: ключевые этапы, оборудование и решения

Downstream-процесс — это, грубо говоря, процесс выделения и очистки вашего финального продукта от клеточного дебриса и биологических субстанций. Upstream и downstream тесно взаимосвязаны: upstream без downstream не имеет значимости. У вас могут быть отличные титры продукта, феноменальная наработка, прекрасно подобранный upstream-процесс — но если downstream не налажен, вы теряете 90–95% продукта и ломаете голову, что же не так.

Самые частые ошибки в downstream-процессе:

• Низкий выход.Часто это не критический сбой на одном этапе, а маленькие недочёты на каждом этапе, которые в сумме приводят к снижению выхода.
• Проблемы с продуктом. Низкий выход может быть связан с деградацией продукта, агрегированием или несоответствием по чистоте на этапе получения финального лекарственного препарата. Это приводит к потере сил, времени и денег.

Схема downstream-процесса может меняться в зависимости от многих факторов. Например, от того, где секретируется ваш продукт — в клеточную жидкость или внутриклеточно. Это определяет первичные этапы выделения: центрифугирование, гомогенизация и так далее.

Также важно знать особенности вашего продукта. Часто это связано с работой с белками, потому что белки — штука капризная. Бывает, что в лаборатории или на производстве есть один налаженный downstream-процесс, который хорошо показал себя с одним конкретным белком. Люди применяют этот протокол к другому белку, говоря: «Ну, он же похож». В целом протокол может работать, но выход будет крайне низким, либо будут постоянно забиваться колонки и мембраны. Это определяется особенностями, которые не были учтены при проектировании процесса: возможно, не подходит буфер для нового агента, либо плохо подобрана температура. Всё это нужно заранее исследовать или отрабатывать на некрупных масштабах.

Также важно определять требования к чистоте продукта. Препарат для ветеринарных целей и для исследования на людях — это два разных препарата с различными требованиями по чистоте и глубине валидации. Это влияет на этапе полировки и формирования финальной формы. И последующее масштабирование: не все продукты могут быть смасштабированы, как ни странно это звучит.

Первичное выделение — это то, с чего начинается любой downstream-процесс. Вы наработали биомассу в биореакторах, и вам нужно получить ваш продукт, минимизировать его повреждения и увеличить выход. Это база, фундамент вашего downstream-процесса. От него зависят последующие этапы очистки и формулировки.

Основные методы первичного выделения:

• центрифугирование;
• лизис;
• гомогенизация;
• глубокая фильтрация;
• флокуляция.

Наиболее распространённый метод — центрифугирование. Он используется в 95% случаев в downstream-процессе, потому что это дешёвый, высокоэффективный и хорошо зарекомендовавший себя процесс. Сейчас на рынке множество решений для поддержания температуры. Раньше проблема была в том, что образец мог сильно греться, что критично для многих продуктов. Сейчас полно центрифуг с поддержанием постоянной температуры, что позволяет внедрять этот метод практически на любой этап.

Зачем он нужен? У вас есть биомасса, допустим, дрожжевая, и вам нужно отделить клеточную жидкость от самой биомассы дрожжей. Для этого и применяется центрифуга. После центрифугирования вы забираете тот компонент, который вам необходим: иногда это клеточная жидкость, если продукт секретируется в неё, иногда — сама биомасса.

Гомогенизация и лизис применяются при внутриклеточной продукции, чтобы добраться до самого продукта.

Гомогенизация бывает различной:

• Механическая — используются стеклянные шарики, поршни, металлические шарики или лопатки. Это просто механическое разрушение тканей и клеток под действием физического воздействия.
• Ультразвуковая — часто используется в лабораторных масштабах, когда с помощью ультразвука и гравитационных ударов разрушают клеточную стенку бактерий, дрожжей и иногда эукариот.
• Химический лизис — бывает ферментативный, через осмотический шок (резко меняете количество солей в растворе) и с помощью детергентов, но они часто выступают как вспомогательные элементы.

Один из самых распространённых методов сейчас — гомогенизация высокого давления. Разрушение клеток происходит за счёт резкого перепада давлений, возникают кавитационные удары, адиабатическое расширение, и клетки не выдерживают и разрушаются. Этот метод набирает обороты, потому что у него отличная масштабируемость, он хорошо подходит для большинства агентов и его можно хорошо оптимизировать: варьировать давление, подбирать количество циклов, температуру, длительность обработки.

Компания Диаэм представляет на сайте гомогенизаторы от компании Yocell — лабораторные, пилотные и производственные. Лабораторные гомогенизаторы можно предоставить на демо-тестирование.

Зачастую лучшая эффективность достигается, когда вы комбинируете центрифугирование с глубокой фильтрацией, чтобы подготовить образцы для следующего этапа.

При работе с крупными партиями продукта могут потребоваться специализированные центрифуги. Для лабораторных масштабов достаточно обычных настольных или напольных центрифуг. Для более крупных масштабов нужны центрифуги с проточным ротором, которые представлены на нашем сайте.

Принцип работы таких центрифуг: ротор ставится в центрифугу, жидкость поступает в ротор и проходит по нему, выходит снова из ротора, а нерастворимые фракции остаются на стенках ротора. Вы прогоняете определённое количество продукта через ротор, затем ротор достаётся, открывается, и специальным скребком вы выгребаете продукт и собираете его.

Такие центрифуги нужны, когда объём составляет десятки литров, иногда сотни литров. Для больших объёмов — сотни-тысячи литров — используются трубчатые центрифуги. Принцип их работы похож: жидкость постоянно поступает, ротор вращается, жидкая фракция выходит, нерастворимое остаётся в роторе. Но это более специализированный продукт: здесь нет сменных роторов, здесь только один сложный большой ротор. После центрифугирования вы также достаёте продукт скребком. Бывают более сложные варианты, когда с помощью такой центрифуги можно разделять не только нерастворимую фракцию от растворимой, но и жидкости разной плотности.

Когда вы получили продукт, выделили его и провели первичное выделение, он находится в растворе. Обычно план очистки состоит из нескольких этапов.

Чаще всего на первом этапе используется аффинная хроматография, чтобы отделить целевой продукт от нежелательных веществ.

Затем следует этап концентрирования образца, смены буфера, смены солей и состава буфера.

Следующий этап — дополнительная хроматографическая очистка. Обычно используется не аффинная, а гель-фильтрация или ионообменная хроматография. Иногда используется гидрофобная хроматография.

После этого этапа вы также можете провести тангенциальную фильтрацию (ТФФ), чтобы поменять буфер, сконцентрировать образец или как-то иначе с ним поработать.

Тангенциальная фильтрация — очень широко распространённый метод, потому что его можно применять практически на любом этапе downstream-процесса. Фактически его можно вставлять после каждого этапа: вы выделили продукт и тут же можете провести ТФФ. Можно даже перед первичной очисткой, перед аффинной хроматографией, сконцентрировать образец с помощью ТФФ-системы и сменить буфер на подходящий для проведения хроматографии. После хроматографии — снова для смены буфера или концентрирования. Это достаточно гибкий метод, и сейчас многие его используют.

На практике сотрудники лабораторий и производств концентрируют продукты в 10–20 раз, что невероятно ускоряет дальнейшие процессы хроматографической очистки. Также с помощью ТФФ можно очищать продукты от нежелательных крупных или мелких молекул, которые мешают при хроматографии.

При проведении тангенциальной фильтрации важно учитывать параметры: размер образца и размер пор в мембране, давление, концентрацию, вязкость. Это всё очень важные параметры, которые могут повредить ваши молекулы или привести к низкому выходу.

Среди систем для тангенциальной фильтрации можно выделить оборудование компании ChallengeIM. У них широкая линейка: от простых лабораторных моделей до сложных промышленных, с отличным контролем давления и скорости потока, воспроизводимостью и лёгкой масштабируемостью. ТФФ-систему Dream мы также можем предоставить на демо-тестирование. Кроме того, можем предложить российскую ТФФ-систему — простую в использовании, без автоматизации, отлично подходящую для лаборатории и небольших объёмов до литра. Её также можем предложить на демо. В нашем каталоге представлен «МК TFF Лабсет А»

Один из самых важных методов в downstream-процессе — хроматография. Это основной способ очистки. Но хроматография — достаточно общее слово, потому что за ним скрывается много методов разделения частиц по физико-химическим свойствам.

Важно заранее, перед началом экспериментов, провести исследовательскую работу и определить, как вы будете выделять ваш образец, к каким условиям он чувствителен. Гидрофобен он, какой у него заряд, есть ли аффинность? Возможно, вы пришьёте какую-то метку к белку, чтобы очистить его аффинно. Методов хроматографии множество: ионообменная, гель-фильтрация, гидрофобная, аффинная. Все они широко распространены и применяются в downstream-процессе, но важно понимать, какие методы нужны именно вам, потому что это может быть дорогостояще и длительно.

Важно понимать, что если вы работаете с белками, некоторые белки при концентрировании на ТФ-системе могут образовывать агрегаты, допустим, при концентрации больше миллиграмм на миллилитр. Вы этого не знали, не проверили, и когда пытаетесь провести хроматографию, агрегаты забивают колонку. Вы ломаете голову, что же случилось, и у вас летит сорбент. Поэтому надо заранее всё продумывать.

Для таких работ мы представляем хроматографы среднего давления от компании Taidu. У них высококлассное качество компонентов и различных датчиков, они подходят для разработки методов, контроля качества и мелкомасштабной очистки. Множество методов можно на них проводить. Эти хроматографы зарекомендовали себя отлично на рынке. Также, как и ТФФ-систему, можем предоставить данную систему на демо.

После очистки идёт полировка и отработка финальной формы продукта. Полировка — это также очистка, но дополнительная, необходимая для удаления отдельных элементов: остаточных следов ДНК, вирусных частиц, сахаридов. Здесь можно проверить пирогенность, эндотоксины и удалить их с помощью хроматографии и подбора специальных смол.

Разработка финальной формы: чистый продукт — не значит стабильный. Многие продукты требуют, чтобы вы заранее разработали условия, при которых продукт не будет терять активность, не будет деградировать, будет активен и так далее. На предыдущих этапах вам тоже важно отслеживать, при каких условиях продукт наиболее стабилен, но там это может отслеживаться, допустим, месяц. А в данном случае вы должны понять, что белок не разрушается и не теряет активность в течение года или двух. И как он переносит заморозку-разморозку.

Если у вас падает выход, вам нужно проверить эффективность первичных этапов, то есть восстановление, потери при фильтрации и так далее. Чистота — проверять селективность ваших смол при хроматографии либо методов очистки. Также строгость процесса: нужно внимательно следить за людьми, которые работают за оборудованием.

Самые распространённые ошибки, которые я встречал:

• Неправильный подбор мембраны при работе с ТФФ-системами. Вы можете теоретически предсказать, какой размер пор вам нужен, но это не всегда возможно. Даже если возможно, вы знаете размер частицы и размер пор, покупаете сразу большую партию, потому что всё теоретически просчитали. Но на практике теория не всегда сходится. Нужно заранее узнать размер частицы дополнительными исследованиями либо просто взять несколько небольших мембран с различным размером пор и протестировать на небольших партиях.
• Разрушение продукта. Одна из самых распространённых проблем. Белки особенно капризны: небольшой чих может привести к разрушению. Чаще всего это неправильно подобранный буфер, условия хранения, слишком агрессивное воздействие — с помощью pH, скоростей потока и так далее.
• Другие ошибки. Их все перечислять не буду, но основные понятны.

Заключительным этапом, часто, но не всегда, downstream-процесса может быть изменение формы хранения вашего продукта, потому что так он хранится лучше. Для этого на сайте Диаэм представлены лиофильные и распылительные сушки. С лиофильной сушкой многие знакомы, подробно останавливаться на ней не буду.

Downstream — это важный процесс, который определяет цену и стоимость затрат вашего производства сильнее, чем upstream. Именно здесь строится стратегия разработки процесса получения продукта. Важно заранее всё обдумать, подойти к каждому шагу стратегически, не работать на эмоциях и не подбирать методы только потому, что когда-то они хорошо зарекомендовали себя. Лучше сосредотачиваться на сегодняшнем дне и работать с продуктом как с новым: подбирать условия, внимательно анализировать, использовать биоинформатические методы, проводить тестирование на небольших партиях, а потом уже переходить к масштабированию. Правильный подбор оборудования позволяет настроить автоматизацию и воспроизводимость ваших экспериментов.