Что такое Раман и применение Раман-спектроскопии для фенотипирования единичных клеток. Перспективность применения систем FlowRACS в сортировке единичных клеток

Почему Раман-спектроскопия сейчас важна?

Сегодня многие лаборатории ищут альтернативные технологии клеточного анализа, особенно когда речь идёт о:

• неинвазивном анализе,
• безметочном анализе (без флуоресцентных или белковых меток),
• сортировке по функциональному состоянию, а не только по маркерной экспрессии,
• повышенной жизнеспособности клеток после сортировки (для последующего культивирования, секвенирования, или терапевтических применений).

Раман-спектроскопия даёт доступ именно к таким возможностям.

Технология, о которой мы говорим сегодня, позволяет:

• работать абсолютно без окрашивания — не требуются антитела, красители или генетические модификации;
• проводить неинвазивный анализ: клетка в процессе анализа практически не повреждается;
• оценивать не только морфологию, но и химический состав, метаболический статус клетки;
• осуществлять сортировку с высокой точностью — пригодную для последующего культивирования или single-cell RNA/DNA-секвенирования.

История и основы Раман-спектроскопии

Прежде чем мы перейдём к приборам FlowRACS, я расскажу кратко о том, что такое Раман-спектроскопия и почему её применение для анализа клеток — это действительно революционный шаг.

Как открыли Раман-спектроскопию?

Явление, на котором основана технология, было открыто почти сто лет назад. В 1928 году Ландсберг и Мандельштам наблюдали его на кристаллах кварца, а через несколько недель тот же эффект был независимо открыт в Индии Ч.В. Раманом, который использовал солнечный свет для изучения рассеяния на жидкостях.

В результате за это открытие Ч.В. Раман в 1930 году получил Нобелевскую премию по физике, а во всём мире метод стал известен как Раман-спектроскопия (в России иногда также используется термин "комбинационное рассеяние").

В чём суть Раман-спектроскопии?

Когда фотон света сталкивается с молекулой вещества, он может быть рассеян разными способами:

1. Упругое рассеяние (эффект Рэлея) — энергия фотона не меняется.
2. Неупругое рассеяние (Раман-эффект) — фотон передаёт часть своей энергии молекуле (или наоборот — получает энергию от возбужденной молекулы).

В результате мы видим сдвиг частоты света (т.е. изменение длины волны), который зависит от внутренних колебаний молекул — это их "отпечаток пальца".

Таким образом, Раман-спектр вещества даёт нам информацию о:

• составе молекул,
• химических связях,
• структурных особенностях,
• метаболической активности.

Для биологии особенно важно, что:

• у каждой молекулы — уникальный спектр;
• в клетке спектр является суммой спектров всех молекул;
• можно различать липиды, белки, нуклеиновые кислоты и пр.;
• можно отслеживать динамику метаболизма (например, за счёт включения дейтерия из тяжёлой воды).

Структура Раман-спектра клетки

На спектре можно выделить несколько областей:

• 400–1700 см⁻¹ — "отпечатки пальцев" (основная область различия клеток).
• 2800+ см⁻¹ — сигналы липидов, белков, нуклеиновых кислот.
• 1800–2700 см⁻¹ ("молчащий регион") — в норме пустой, но на нём видны сигналы, связанные с метаболизмом (например, при введении изотопов).

FlowRACS — как работает?

Это не проточный цитометр! Это прибор, который работает как "умный микроскоп с сортировкой".

Основные компоненты системы FlowRACS

• кварцевый чип с электродами (на который подаётся клеточная суспензия);
• лазер 532 нм — возбуждение Раман-спектра;
• система положительного диэлектрофореза — выстраивает клетки по линиям электродов;
• точка анализа — фиксированная фокусная точка лазера;
• револьвер с объективами (10х, 50х, 60х, 100х);
• оптический пинцет (1064 нм) — для управления отдельными клетками.

Процесс работы FlowRACS

• Подача клеток — суспензия подаётся насосом в канал чипа.
• Диэлектрофорез — клетки выстраиваются по линиям электродов (по одной на вершину "галочки").
• Точка фокусировки — клетка фиксируется в луче лазера.
• Снятие Раман-спектра — спектр сразу отображается в софте.
• Решение о сортировке — если спектр соответствует заданным критериям — клапан перенаправляет клетку в пробу.
• Сортировка — клетки собираются в фракционные пробы.

Технические характеристики FlowRACS

• Скорость анализа: до 3000 событий/мин.
• Скорость сортировки: 300–2000 событий/мин (в зависимости от типа клеток).
• Диаметр клеток: 1–40 мкм.
• Объективы: 10х, 50х, 60х, 100х.
• Устройство позволяет обрабатывать археи, бактерии, водоросли, клетки млекопитающих, клетки растений.

Примеры применения FlowRACS

В ходе практического применения приборов FlowRACS накоплен обширный опыт использования этой технологии для различных задач. Далее приведу несколько примеров экспериментов, которые демонстрируют её возможности.

Пример 1: Фенотипирование клеток крови

Одно из применений — фенотипирование клеток крови по их Раман-спектрам.

В представленном в вебинаре эксперименте было проведено разделение клеток крови на две субпопуляции.

Результат:

• Точность разделения составила 99,6%.

Что важно: несмотря на то, что визуально Раман-спектры этих двух популяций были очень похожи (в диапазоне "отпечатков пальцев" 400–1700 см⁻¹ отличия были минимальны — например, дополнительный пик в одной популяции, едва различимое смещение в районе ~900–1000 см⁻¹), прибор был способен с высокой точностью распознавать эти нюансы и разделять клетки.

Это демонстрирует, насколько чувствителен алгоритм анализа и насколько точна оптика FlowRACS при сравнении очень похожих популяций.

Пример 2: Разделение смеси клеточных культур

В другом эксперименте была создана смесь из 4 различных линий клеток млекопитающих:

• T24 — рак мочевого пузыря человека;
• A549 — аденокарцинома лёгкого человека;
• OSRC2 — карцинома почки;
• MCF7 — рак молочной железы.

Смесь подавалась в прибор FlowRACS.

Цель: проверить возможность идентифицировать и разделить клетки разных линий на основе их Раман-спектров.

Результаты:

Даже при небольшой разнице в спектрах (например, характерные пики в районе ~1123 см⁻¹ и ~933 см⁻¹), прибор позволил надёжно разделять клетки.

Таким образом, FlowRACS позволяет использовать Раман-спектроскопию как безмаркерный метод для высокоточного фенотипирования клеток разных линий.

Пример 3: Оценка метаболической активности E. coli

Следующий пример показывает ещё одну уникальную возможность Раман-спектроскопии — отслеживание метаболизма клеток.

В эксперименте оценивалась метаболическая активность E. coli при воздействии различных антибиотиков.

Метод:

• Клетки E. coli инкубировали в среде с тяжёлой водой (D₂O).
• Затем подвергали воздействию различных антибиотиков.
• После этого с помощью FlowRACS снимались Раман-спектры клеток.

Что важно: в "молчащем регионе" (1800–2700 см⁻¹) появлялись пики, связанные с включением дейтерия в молекулы клетки (CD-сигналы).

По интенсивности этих пиков можно было судить о:

• уровне метаболической активности клетки;
• чувствительности клетки к конкретному антибиотику.

Результат: препарат-зависимое изменение уровня включения дейтерия, что позволяет использовать FlowRACS для скрининга антибактериальной чувствительности на уровне единичных клеток.

Прибор RACS-Seq

Следующий прибор в линейке — RACS-Seq.

Это интегрированная система, которая использует:

• оптический пинцет (лазер 1064 нм);
• Раман-спектроскопию (или, при необходимости, флуоресцентный / морфологический анализ).

Особенность: здесь не используется диэлектрофорез (как в FlowRACS), а манипуляция клетками осуществляется оптическим пинцетом.

Конфигурация

• В приборе используется чип другого типа — без электродов.
• Камера анализа представляет собой небольшой объём, куда подаются клетки.
• Через объектив микроскопа оператор наблюдает клетки в реальном времени.
• Можно вручную наводить лазер на отдельные клетки.

Принцип работы

Подача клеток → в камеру.

Наблюдение оператором → оператор вручную или в автоматическом режиме снимает Раман-спектр.

Выбор клеток для сортировки → либо по Раман-спектру, либо по морфологии, либо по флуоресценции.

Сортировка:

• клетки перемещаются оптическим пинцетом;
• помещаются в микрокаплю или в пробирку (в автоматическом режиме возможна работа с каруселью пробирок).

Характеристики RACS-Seq

• Размер клеток: 1–35 мкм.
• Скорость анализа: 1–2 события в минуту (ручная работа требует времени).
• Сбор клеток: 2–10 клеток в минуту при автоматической работе.

Применение

Прибор особенно подходит для задач, где важна абсолютная индивидуальная работа с клеткой:

• подготовка клеток для single-cell RNA-seq или DNA-seq;
• отбор редких клеток из сложных смесей;
• работа с трудными объектами (например, агрегирующимися клетками);
• культивирование единичных клеток.

Пример: подготовка клеток в микрокапли

В приборе клетки помещаются в индивидуальные микрокапли — это обеспечивает:

• минимизацию загрязнений;
• сохранение жизнеспособности;
• возможность прямого переноса в капельные платформы для single-cell RNA-seq.

Видео-демонстрация

В ходе вебинара демонстрировалось:

• как оператор управляет пинцетом;
• как клетки "захватываются" в луч и переносятся в микрокаплю.

Важно: оператор полностью контролирует процесс, видит в реальном времени положение клетки и её спектр.

Прибор EasySort Compact

EasySort Compact — самый компактный прибор из линейки.

Главное отличие:

• здесь не используется Раман-спектроскопия;
• сортировка происходит по:
• морфологии (визуальный отбор),
• флуоресценции.

Принцип

• Тот же чип, что у RACS-Seq.
• Тот же оптический пинцет (лазер 1064 нм).
• Управление — вручную или автоматически.

Особенность EasySort Compact

Можно устанавливать прибор в ламинарный шкаф!
В отличие от FlowRACS и RACS-Seq, которые требуют оптического стола, EasySort Compact не боится вибраций → возможно использование прямо в стерильных условиях.

Применение

• Стерильная работа с клеточными культурами.
• Сортировка по морфологии (например, выбор клеток определённой формы, размера и т.п.).
• Сортировка по флуоресцентным меткам.
• Быстрая подготовка материала для single-cell RNA-seq.

Производительность

• Скорость — 1–2 клетки в минуту.

Видео-демонстрация

В вебинаре демонстрировалось:

• работа оператора с прибором;
• выбор и захват клетки пинцетом;
• перемещение клетки в микрокаплю или пробирку.

Примеры публикаций

Технология FlowRACS уже успешно применяется в ряде научных проектов.

Пример:

• Nature, 2022:
  "Определение видового состава и метаболизма фосфор-солюбилизирующих бактерий в океанической воде".

В работе:

• отбирались клетки с наибольшей способностью к солюбилизации фосфора;
• применялась тяжёлая вода (D₂O) для оценки метаболической активности;
• отбор осуществлялся на приборе FlowRACS.

Это пример того, как методика позволяет объединить скрининг метаболической активности с сортировкой единичных клеток, что крайне востребовано для микробиологии, экологии, фармакологии.

Заключение

На сегодняшний день системы FlowRACS, RACS-Seq и EasySort Compact представляют собой уникальные инструменты для:

• безмаркерного фенотипирования клеток;
• сортировки единичных клеток для downstream-анализов (например, single-cell секвенирования);
• метаболического анализа клеток;
• анализа трудных объектов (включая клетки с высокой чувствительностью к стрессу, редкие популяции и т.п.).

Перспективные области применения:

• Прецизионное фенотипирование клеток.
• Работа с редкими популяциями (например, Circulating Tumor Cells).
• Сортировка для single-cell RNA/DNA-seq.
• Исследование клеточного метаболизма.
• Скрининг антибиотиков, антипаразитарных препаратов.

Практическая информация

• Расходные материалы: чипы и буферы.
• Один набор включает: буфер для пробоподготовки, буфер для промывки, чип (на 10 процедур).
• Приборы рассчитаны на работу с одноразовыми чипами.
• Цены: информация доступна у менеджеров по продажам ДИАЭМ.